皮肤吸收体内试验方法

Skin Absorption-In Vivo Method

（征求意见稿）

1 范围

本方法规定了皮肤吸收体内试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法、试验数据和报告。

本方法适用于化妆品原料经皮吸收的体内试验。

2 试验目的

本方法阐述了化妆品原料经皮吸收的体内试验方法，以便为化妆品原料的毒性分级、标签标识和应用提供试验依据。本试验方法适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。

3 术语和定义

未吸收剂量（unabsorbed dose）:染毒暴露以后从皮肤洗脱下来的剂量、附着在开放性覆盖物的剂量，还包括在染毒过程中从皮肤表面蒸发的量。

吸收剂量（absorbed dose）：染毒部位皮肤处理以后，包括在尿液、笼具清洗液、粪便、呼气（如果可测）、血液、各种组织（如果可采集）以及尸体残留的剂量。

可吸收剂量（absorbable dose）:皮肤清洗后存留在皮肤上或皮肤内的剂量。

4 试验的基本原则

将受试物（如放射标记物）以符合实际使用情况的制剂形式按一个或多个剂量涂布于动物剃毛后的皮肤上，然后覆盖上合适的保护装置（开放式、半封闭式和封闭式）以防止动物舔舐样品，并让受试物制剂与动物皮肤持续接触暴露一段时间。在暴露时间结束后，取下覆盖物并用合适的清洁剂清洗动物皮肤，保留用过的覆盖物和清洗液以备分析测定，然后换上新的覆盖物。在试验前、试验期间和试验结束后，动物需要一直单独饲养于代谢笼中，收集其排泄物和呼出气以备分析测定。如果有充足的证据表明极少产生或不产生挥发性的放射性代谢产物，则可以不收集动物呼出气。每个试验通常包括多个试验组，其中一个试验组动物在染毒结束后立即处死，其他试验组动物可根据试验计划在染毒结束后间隔不同时间处死。在每一个采样时间点处死相关存活动物，采集血样以及染毒部位皮肤进行分析测定；此外，对残留在动物尸体内未被排泄出的代谢物也要进行分析测定。最后，用适当的分析方法对采集的样品进行分析测定，并估计透皮吸收的程度。

5 试验方法

5.1 受试物

受试物应该作为一个整体对其透皮吸收特性进行研究。理想情况下，应该用放射性标记受试物。

受试物应进行适当配制后用于测试。受试物的配制（比如纯品、稀释品或者含有受试物的制剂）应与人类或者其他目标种属动物接触该物质的形态一致或相似；任何不同于实际使用情形的改变均应给出合理的解释。必要时可以将样品溶解或者均匀分散于溶媒中，应该了解溶媒（水除外）的皮肤吸收特征以及与受试物的相互作用。

5.2 实验动物和饲养环境

5.2.1 动物物种、品系的选择

大鼠是最常用的实验动物，但是也可以根据检测原料性质的不同使用皮肤吸收率和人类更相似的裸鼠以及其他品系动物。一般选用成年健康的单性别动物（通常用雄性）。试验开始时，实验动物体重差异不应大于平均体重的20%。比如，雄性大鼠体重一般应在200～250g范围之内，最好是在该范围的上半区内。

5.2.2性别和数量

每个样品采集以及每个设定的观察时间点需设一个试验组，每组至少4只相同性别动物。在每一段时间间隔处死一组动物，比如在染毒结束时（通常是6h或24h）和后续观察期结束时（例如48h和72h）。如果已有资料表明受试物的经皮毒性有明显雌雄性别差异，应选用更敏感的性别；如果没有资料，则任选一种。

5.2.3饲养环境

动物实验室温度应在22℃±3℃；相对湿度应在30%～70%之间，但尽可能达到50%～60%。人工控制光照，明暗12h交替。动物常规饲料喂养，自由饮水。在试验期间（最好也包括适应期间），动物应在代谢笼中单笼饲养。因食物和水的溢出会影响到试验结果，要尽量避免及减少此类情况发生。

5.3 试验步骤

5.3.1 试验动物的准备

标记动物以便识别，并在研究开始前进行至少五天适应性喂养，使动物适应实验室条件。

适应期后（大约染毒前24小时），剃除每只动物肩部和背部的毛发。因受损皮肤后可能改变皮肤的渗透特性，因此剃除毛发时要注意避免损伤皮肤。剃毛后（大约在皮肤染毒前24小时），用丙酮轻轻擦拭皮肤表面以去除皮脂。不建议另外用肥皂和水清洗皮肤，因为任何肥皂残留物都可能促皮肤对测试物质的吸收。剃毛面积应该足够大，以便能够较准确的计算出每平方厘米皮肤上受试物的吸收量。对于体重在 200～250 克范围内的大鼠，剃毛皮肤面积应该至少为10 cm²。动物准备完毕后，重新放回代谢笼。

5.3.2 皮肤染毒

选用特定面积的特定皮肤位置。然后将已知量的测试制剂均匀地涂于该部位。该量通常应模拟潜在的人体用量，通常为 1～5 mg/cm² 的固体或10μl/cm²的液体。可根据试验具体条件、试验目的以及受试物的物理性质等调整染毒剂量，但应有适当理由。染毒后，受试部位应避免被触碰。通常，受试部位应采用非闭合的遮盖装置覆盖（如使用透气尼龙纱布），典型装置的示例如图1所示。某些特定情况下，受试部位应采取闭合性保护。若半挥发性测试物质的挥发导致受试物的回收率超出可接受的范围（另见5.4），此时则有必要在在受试物装置上覆盖活性炭过滤器以捕获挥发的受试物（见图1）。任何覆盖物都不应损伤皮肤，也不会吸收或与受试制备物发生反应。染毒后，将动物放回单独的代谢笼中以收集排泄物。

图1 一种用于覆盖和保护受试部位皮肤的典型遮盖装置设计示例图

5.3.3 染毒时间和取样

染毒期是指在皮肤开始接触受试物，至清洗去除受试物之间的时间间隔。所采用的染毒时间（一般为6或24h）应与通常人体可能的接触时间相对应。染毒结束后，将动物饲养于代谢笼中保留直至预定的处死时间点。染毒结束后，应对受试皮肤进行观察并记录任何可见的刺激症状。

在整个研究过程中，应采用代谢笼单独收集尿液和粪便，并可在¹⁴C-标记的二氧化碳和挥发性¹⁴C化合物(>5%)产生时进行收集和定量分析。尿液、粪便和捕获液（如¹⁴C标记的二氧化碳和挥发性¹⁴C化合物）应在每个取样时间点从每组中单独收集。若有足够的信息证明很少或几乎不产生放射性代谢物，则可采用开放式笼架。整个试验期间，应定期观察动物的毒性/异常反应。

染毒期，从开始皮肤接触后至24h以及随后的每一天，均应收集排泄物直至试验结束。一般而言，虽然三个排泄物收集间隔时间点通常就足够了，但某些受试制备物的特征或现有动力学数据可能会要求有更合适的或更多的收集时间点。

染毒结束时，从每只动物身上移去保护装置并单独保留以便试验分析。所有动物的受试部位皮肤应用棉签蘸取清剂清洗至少3次。必须注意避免污染其他部位。清洗剂应为肥皂水等有代表性的常用卫生清洁剂。最后，擦干皮肤，用新的干净遮盖装置覆盖受试部位皮肤，将这些动物放回代谢笼，组成后面时间点的试验动物组。必须保留所有擦洗拭子和洗液以供研究分析。

5.3.4 试验观察和检测

对于每个实验组，应在预定时间处死试验动物，收集血样，移去保护下的装置或覆盖物并进行分析。剪下每只动物的受试部位皮肤以及对应的空白对照部位皮肤，分别进行试验分析。受试部位皮肤可分层，可将角质层与下面的真皮层分离，以提供受试物更多的信息。在染毒之后的这一时段受试物分布的试验分析，将提供其在角质层中转运的某些特征。最后清洗皮肤并处死动物后，应移去保护下的覆盖物，以便于皮肤分层处理。从受试动物身体上环状切下受试部位的皮肤并钉在板上，将粘附性胶条贴于皮肤表面，轻压，胶条将部分角质层粘附下来，继续用胶条重复粘贴，直到胶条不在粘附与皮肤表面，表明角质层已被全部去除。将同一只动物的所有胶条合并至一个单独的容器中，加入组织消化液溶解角质层。

保留每只动物的尸体以便试验分析。在对动物尸体进行吸收剂量试验前，每个可能的靶组织均可被分离单独进行试验。一般而言，仅对尸体的总含量进行分析即可，若有其他研究提示，也可将靶组织分离进行单独试验。动物处死时，膀胱中的尿液应与先前收集的尿液合并在一起进行测试。此外，收集了代谢笼中的粪便后，笼子和捕获装置均应采用合适的溶剂冲洗并收集，其他潜在的受污染仪器也应该进行类似的处理。

5.4 试验分析

所有试验均应达到足够的回收率（如平均 100±10%的放射性），超出回收率范围的应说明理由。每个样品所使用的剂量应采用适宜、有效的方法进行分析。

统计分析应考虑测定每个剂量组的平行样之间的偏差。

6.数据和报告

6.1数据

6.1.1 应对每只动物在每个取样时间的受试物和（或）代谢物进行以下测定（除单个动物的数据外）以便计算吸收剂量、未吸收剂量和可吸收剂量，且不同取样时间点的数据均应按组报告其平均值：

- 保护器具上的量；

- 从皮肤上清除下来的量；

- 在皮肤上/皮肤内、不能从皮肤上洗下的量；

- 血样中的量；

- 排泄物和呼出气体中的量（如适用）；

- 残留在尸体和取下单独试验的器官上的量。

6.1.2 排泄物、呼出的空气、血液和尸体中的受试物和/或代谢物的量，用以确定每个时间点的吸收总量，从而计算出染毒后每平方厘米皮肤吸收受试物的量。

6.2 报告

试验报告应符合试验方案所规定的要求，包括所使用试验系统合理性，具体包括以下内容：

1）受试物：

- 识别数据[如，CAS 编号；来源;纯度（放射化学纯度）；已知杂质；批号];

- 物理性质、物理化学性质（如，pH、挥发性、溶解度、稳定性、分子量和辛醇/水分配系数的对数值lgP_OW）；

2）受试物的制备：

- 配方和使用理由；

- 受试物制备详细过程、使用量、达到的浓度、赋形剂、稳定性和均一性；

3）受试动物：

- 使用的种属/系；

- 动物的数量、年龄和性别；

- 动物来源、饲养环境、饲料、生产许可证明、使用许可证明等；

- 试验开始时每只动物的体重；

4）试验条件：

- 染毒的详细过程（受试部位、分析方法、闭合/非闭合、体积、提取、检测）；

- 食物和水质的详细信息。

5）结果：

- 任何毒性症状；

- 吸收数据列表（以速率、数量或百分比表示）；

- 试验的总体回收率；

- 结果的解释，与该受试物已有的经皮吸收的数据进行比较。

6）结果讨论。

7）结论。

皮肤吸收体内试验方法起草说明

为配合《化妆品新原料注册备案资料管理规定》的实施，有必要建立与其相适应的体内皮肤吸收试验方法及技术指导原则，为该类化妆品原料的安全性评估提供技术保障，中国食品药品检定研究院组织起草了《皮肤吸收体内试验方法》（征求意见稿）。现就起草的有关情况说明如下：

一、起草的必要性

皮肤有吸收外界物质的能力，称为经皮吸收。皮肤最主要的吸收途径是渗透入角质层细胞，再经表皮其他各层到达真皮而被吸收（主要吸收脂溶性物质）；除此之外，还可通过毛囊、皮脂腺和汗腺导管而被吸收（主要吸收水溶性物质）；极少量的物质如钾、钠、汞等可通过角质层细胞间隙吸收。

皮肤吸收功能对维护身体健康必不可少，并且是外用药物治疗疾病及化妆品发挥作用的理论基础，各类外用药物利用皮肤的吸收能力达到治疗疾病的作用，各种美白护肤化妆品利用皮肤的吸收能力来达到祛斑、美白等功效。

在化妆品研究领域，进行经皮肤暴露的安全评估时，皮肤吸收率的检测是一项基础而又非常重要的内容。经皮吸收试验方法可分为两类：体外吸收方法和体内吸收方法，其中，用各类实验动物开展的体内皮肤吸收试验方法能够为受试物的经皮吸收率提供较为可靠的资料。

国外现有的体内皮肤吸收评价方法或指导原则有世界卫生组织（World Health Organization, WHO）2006年发布的《环境健康标准235：皮肤吸收》（Environmental Health Criteria 235: DERMAL ABSORPTION），经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）2004年发布的《皮肤吸收：体内试验方法》（OECD guideline for the testing of chemicals Skin Absorption: in vivo Method），欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）2017年发布的《皮肤吸收指南》（Guidance on dermal absorption），以及美国环保署（United States Environmental Protection Agency，US EPA）1998年发布的《健康效应测试指南：皮肤渗透》（Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.7600 Dermal Penetration）等。我国于2011年发布了国家标准《化学品 皮肤吸收 体内实验方法》（GB/T 27825-2011），该标准所用的试验方法与OECD的方法基本一致。

2021年，我国发布了《化妆品新原料注册备案资料管理规定》，对化妆品新原料注册备案资料要求进行了明确规定，其中在国内外首次使用的具有较高生物活性的寡肽、多肽、蛋白质类新原料，以及拟用于皮肤部位的纳米新原料，要求提交皮肤吸收/透皮试验资料。因此，有必要建立与其相适应的体内皮肤吸收试验方法及技术指导原则，为该类化妆品原料的安全性评估提供技术保障。

二、起草原则与思路

查阅国内外关于药物、化学物质皮肤吸收的体内试验方法，对不同的试验方法进行对比、分析，从而转化、建立适用于化妆品原料皮肤吸收率检测的试验方法，用于具有较高生物活性物质或纳米级物质的皮肤吸收率检测。在建立体内皮肤吸收率试验方法时，明确对受试物的要求、实验动物的选择及饲养条件、实验组和对照组的设置、阳性对照物的选择、皮肤染毒方式、染毒暴露时间、样品采集与检测、数据统计方法、结果判定原则等内容，并起草皮肤吸收体内试验方法实验报告范例。

根据研究所得的试验方法，制定技术指导原则，如适用范围、评价指标、统计学方法、结果判定原则等，建议作为具有较高生物活性物质或纳米级物质等申报化妆品新原料时的安全性评价技术审评原则。

三、主要内容

（一）研究方法

查阅国内外关于药物、化学物质皮肤吸收的体内试验方法，通过对比分析，转化为化妆品用原料皮肤吸收体内试验方法，明确其适用范围、受试物要求、实验动物的选择与饲养、暴露方式及条件、样品采集与检测、数据统计方法、结果判定原则等。在此基础上，梳理该试验方法的关键技术指标，通过专家论证及征求意见，并对反馈意见进行了研究和吸纳，起草了皮肤吸收体内试验技术指导原则。

1.实验动物。根据国内外文献、动物伦理要求和试验指导原则对试验动物的种类、性别、体重、数量、饲养条件、适应性饲养时间等条件进行规定，并根据皮肤吸收试验的特点规定动物每笼饲养数量、动物分组等。

2.暴露方式及条件。根据受试物的物态对皮肤吸收的暴露方式进行规定，包括受试部位、受试物浓度及用量、受试部位的保护、暴露时间等。

3.样品采集与检测。根据受试物及实验动物的特点，对样品采集的范围及时间点进行规定，包括实验动物的尿液、粪便、捕获液、遮盖物、擦洗试子、洗液、血样、受试部位皮肤、动物尸体或靶组织、饲养笼清洗液等，并采用适宜、有效的方法进行检测。

4.数据统计分析。对试验数据的统计分析方法进行规定，包括不同时间点的回收率、吸收剂量、未吸收剂量、可吸收剂量等，从而计算出染毒后每平方厘米皮肤吸收受试物的量。

5.试验报告编写。根据所制定的试验方法对试验报告的内容进行规定，包括受试物的描述及制备、实验动物相关信息、染毒方法、试验结果的统计分析及解释、试验结论等。

6.技术指导原则制定。根据所制定的试验方法及试验报告的内容，制定相应的技术指导原则，包括该试验的适用范围、评价指标、统计学方法、结果判定原则等。

（二）技术路线