28天重复剂量吸入毒性试验

 28-Day Inhalation Toxicity Study

（征求意见稿）

1  范围

本规范规定了啮齿类动物28天重复剂量吸入毒性试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的28天重复剂量吸入毒性的评价。

2  试验目的

对于有短期反复吸入暴露可能的化妆品原料，需进行28天重复剂量吸入毒性试验。通过该试验不仅可获得一定时期内反复吸入受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计吸入的无有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量风险评估。

3  术语与定义

3.1  28天重复剂量吸入毒性

是指在有限时间（28天）内，每日反复通过吸入途径接触受试物后所引起的不良反应。

3.2  气溶胶 aerosol

悬浮在空气中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固态、液态或固液态混合颗粒状物质。

3.3  空气动力学直径 aeodynamic equivalent diameter(AD)

气溶胶颗粒与不同直径标准单位密度（1.0 g/cm³）球形颗粒中某一颗粒的终端沉降速度相同时，该标准球形颗粒的直径即为空气动力学直径。其计量单位为μm。

3.4  空气动力学质量中位数直径 mass median aerodynamic diameter(MMAD)

气溶胶中小于和等于某一空气动力学直径的颗粒总质量，占全部颗粒物质量50%时，该直径即为空气动力学质量中位数直径。

3.5  几何标准差 geometric standard deviation(GSD)

用以描述气溶胶颗粒大小的分布状态。以撞击器各级累积百分比为Y轴、粒径为X轴拟合对数概率曲线，以累积百分比84.1%对应的粒径除以累积百分比50%的粒径，即为几何标准差。

3.6  理论浓度 nominal concentration

制备气溶胶消耗受试物的量除以通过暴露系统的空气总体积。

3.7  实际浓度 analytical concentration

暴露系统中动物呼吸区经采样分析获得的气溶胶浓度。

3.8  口鼻暴露 nose-only

即仅头部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，试验过程中将动物置于相应固定器内进行吸入暴露。

3.9  全身暴露 whole-body

将动物置于封闭的染毒柜或腔体内进行吸入暴露的暴露模式。

4 试验的基本原则

以不同剂量受试物每日吸入给予各组实验动物，连续染毒28天，每组采用一个吸入剂量染毒。染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行称重和尸检。染毒结束后，处死存活动物，进行尸检、临床检查、支气管肺泡灌洗检查以及适当的病理组织学检查，以评估受试物产生的吸入毒性作用。

5 试验方法

5.1  受试物

受试物可分为气态受试物、沸点较低易挥发的液态受试物、高沸点不易挥发液态受试物、粉状或固体受试物。试验时将受试物制备成何种物态（气溶胶、粉尘）取决于受试物的理化性质、设定的浓度和/或按照实际加工使用期间的物理状态等。吸湿性的及会发生化学反应的受试物，在试验中需保证所用空气干燥，某些受试物经超声雾化时会产热，应注意选择适合的发生装置。

5.2  实验动物和饲养环境

5.2.1  动物种系的选择

常规选择啮齿类动物，首选大鼠。一般选用7周～9周龄的成年大鼠。每个性别动物体重的变动范围不应超出动物平均体重的20%。实验动物应符合国家相应规定。

5.2.2  动物的性别和数量

每一剂量组及阴性（溶媒）对照组实验动物至少应有10只（雌雄各半）。可另设追踪观察组，给予最高剂量受试物或阴性（溶媒）对照品，每组至少10只动物（雌雄各半）。

考虑到重复剂量吸入毒性试验的重要性，应适当增加每组动物数。若计划在试验过程中处死动物观察毒性反应，应增加计划处死的动物数。若考虑在试验期间增加影响动物健康的试验操作（如毒代动力学研究），则应另设卫星组，增加相应动物数仅用于满足这部分的研究需要，并不进行毒理学评价。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。追踪观察组动物在全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于14天），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。

5.2.3  试验前动物准备

染毒开始前至少要有5天时间使实验动物适应实验室饲养环境。如动物拟采用口鼻暴露方式染毒，动物还需提前适应口鼻暴露时所用的固定器。

5.2.4  饲养环境

实验动物房应符合国家相应规定，选用标准配合饲料。实验饲养室内温度应控制在20℃～25℃，相对湿度在应控制在40%～70%范围内。采用人工照明，每12h明暗交替。试验期间，动物常规进食，自由饮水。当动物吸入染毒时间超过6h，则需在染毒期间以适合方式给动物喂食，并提供饮水。当动物采用全身暴露方式染毒时，每只动物在暴露期间应处在独立的空间，以防止动物聚集趴卧，其被毛吸附受试物气溶胶，影响动物吸入受试物的量。

5.3  分组

试验通常包括三个暴露水平的受试物和一个阴性/溶媒对照。阴性/溶媒对照组动物暴露于洁净空气或溶媒，溶媒应尽可能采用水，采用其他溶媒进行试验时，应根据文献报道或预试验确认所采用溶媒无吸入毒性，否则应同时设立阴性对照组和溶媒对照组，对照组的其他条件均与受试物组相同。最大吸入暴露水平的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，低暴露水平组应不低于人群的实际吸入暴露水平，且不出现任何毒性作用，中间暴露水平组应引起较轻的可观察到的毒性作用。

吸入试验中动物暴露水平通常以吸入暴露量表述，即气溶胶发生后经动物吸入的气溶胶的量。可根据试验周期中测得气溶胶浓度、每分钟通气量、暴露时间计算求得，公式如下：

每分钟通气量(L/min) = 0.608×BW(kg)^0.852

注：每分钟通气量可采用实际检测动物的每分钟通气量计算。也可以动物平均体重代入经验公式得出动物理论每分钟通气量。BW为动物平均体重。

5.4  吸入暴露条件

5.4.1  吸入暴露方式

首选的暴露方式为口鼻暴露，为满足特定的研究目的（如便于染毒中观察动物反应），也可采用全身暴露方式染毒，但应在试验报告中予以阐释说明。

采用口鼻暴露方式染毒时，所选用的固定器应不对动物产生额外的应激，应注意与动物体重大小匹配，并确保动物在暴露过程中无法避开吸入染毒气流。吸入装置应配备动态气流，其通风量至少应超过装置里动物总换气量的两倍，氧含量应不低于19%，并保证每只动物暴露条件稳定均一。如果进入暴露系统的空气体积小于流出体积时，应防止空气经其他途径进入暴露系统使受试物气溶胶稀释。染毒过程中应使装置内保持轻度负压，防止受试物泄露到外部环境中。

采用全身暴露方式染毒时，吸入装置需配备动态气流，每小时换气约12次～15次，应保证染毒柜内氧含量不低于19%，染毒柜内应密闭，以防止受试物泄露到外部环境中。为保证受试物气溶胶均匀分散，实验动物所占的总体积应不超过染毒柜体积的5%。

5.4.2  吸入暴露浓度

吸入染毒途径不同于其它染毒途径，其暴露水平主要通过调整气溶胶浓度，保持相同的吸入暴露时间来实现。也可调整吸入暴露时间，保持气溶胶浓度不变来实现（如采用此种方式，需排除暴露时间不一致对动物的影响）。

最大吸入浓度设计应考虑：①受试物可达到的最大浓度；②人体可能的最大暴露水平；③维持充足的氧气供应的需要；④动物福利。在缺乏限值数据支持的情况下，气溶胶最大浓度可为5 mg/L，蒸气的最大浓度可为20 mg/L，气体最大浓度可为20000 ppm。

5.4.3  吸入染毒频率

染毒期间，动物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7天。

5.4.4  吸入染毒时间

原则上，各组动物吸入染毒时间应一致，当采用调整吸入染毒时间来区分各组暴露水平时，各组吸入染毒时间相差不应太长，否则需要考察染毒时间不一致对动物的影响。采用口鼻暴露方式时，大鼠的吸入染毒时间应不超过6h，小鼠的吸入染毒时间应不超过4h。采用全身暴露方式时，动物的染毒时间应不少于6h，最长不超过22h。如确需超过上述时间限制，应在试验报告中予以阐释说明。

5.5  暴露条件的监测

5.5.1  浓度监测

试验期间为保证实际浓度的稳定性，可以使用实时监测设备（如气溶胶光度计），或定期通过特异性的方法（如采用撞击器吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行化学分析），或非特异性的方法如滤膜采样法来测定呼吸区或染毒柜内气溶胶浓度，以证明暴露条件的稳定性。浓度波动范围规定：气体或挥发性受试物不得超过平均浓度±10%；液体或固体气溶胶不得超过平均值的±20%。

5.5.2  粒径监测

气溶胶颗粒的空气动力学粒径决定了在重力作用下颗粒在呼吸道中的沉降情况；气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差（GSD）代表气溶胶粒度分布范围，其值越大代表粒子分布较广。为了使动物整个呼吸道充分暴露于受试物中，推荐的气溶胶颗粒空气动力学中值直径（MMAD）数值应介于1μm～3μm，GSD通常应介于1.5～3之间。可采用基于质量检测的碰撞法，基于激光飞行法的光学方法或其它替代方法定期对呼吸区或染毒柜中的气溶胶粒径进行测定，并计算GSD值。如在整个试验周期中采用替代方法进行粒径分析时，需验证替代方法所得结果与碰撞法一致。

5.5.3  暴露装置内气流

通过染毒柜或口鼻暴露系统的气流速率需严格控制，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。

5.5.4  暴露系统内环境监测

暴露系统内温度维持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系统都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。理想的相对湿度一般在30%~70%，但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水溶液型受试物时），应在试验报告中予以阐释说明。氧气的浓度不低于19%，二氧化碳的浓度不超过1%。

5.6  临床观察

染毒期间应每天观察，染毒结束后，追踪观察组还应继续观察至追踪观察期结束。对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应在首次染毒前记录动物体重，此后每周记录动物体重变化。应测定每周饲料消耗量。

5.7  临床检查

5.7.1  眼科检查

在动物染毒前和染毒后，应对所有实验动物，使用眼科镜或其他有关设备进行眼科检查。

5.7.2  血液检查

在染毒结束及追踪观察结束时应测定血球容积、血红蛋白浓度、红细胞数、白细胞总数和分类，必要时测定凝血功能如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激酶时间或血小板数等指标。

5.7.3  临床血液生化检查

在染毒结束及追踪观察结束时进行，检查指标包括电解质平衡、碳水化合物代谢、肝、肾功能。可根据受试物作用形式选择其他特殊检查。推荐的指标包括：氯、钠、钾、禁食血糖（不同动物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶、γ谷氨酰转肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、总胆红素及总血清蛋白。必要时可进行脂肪、激素、酸碱平衡、正铁血红蛋白、胆碱酯酶活性的分析测定。此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其他更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒性评价。

5.7.4  尿液检查

一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。

5.7.5  支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）检查

解剖动物取肺脏，整肺称重后结扎左肺用于组织病理学检查，右肺进行BAL检查，分析BAL液的白细胞计数和分类、总蛋白、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶以及炎症相关细胞因子/趋化因子等参数。BAL液分析通常作为组织病理学检查的结果的补充，但不能替代组织病理学检查。

5.7.6  其他检查指标

可根据研究需要，增加额外的检测指标，如肺功能，行为学分析等。

5.8  病理检查

5.8.1  大体尸检

所有动物均应进行全面的大体尸检，内容包括动物的外观、所有孔道，胸腔、腹腔及其内容物。肺、肝、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、脾、脑和心脏应在分离后尽快称重以防水分丢失。应将下列组织和器官保存在固定液中，以备日后进行病理组织学检查：所有大体解剖呈现异常的器官、脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体）、甲状腺/甲状旁腺、胸腺、左肺/气管、喉、鼻咽组织、心脏、主动脉、唾液腺、肝、脾、肾、肾上腺、胰、性腺、子宫、生殖附属器官*、皮肤*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、膀胱、前列腺、有代表性的淋巴结、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周围神经、胸骨（包括骨髓）、眼及视神经、股骨（包括关节面）*、脊髓（包括颈部、胸部、腰部）*和泪腺*。

*只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官。

5.8.2  病理组织学检查

应对下述器官和组织进行检查：

（1）所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织，如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学的病变，则应扩展至其他剂量组的相应的器官和组织。

（2）各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织。

（3）其他剂量组动物的靶器官。

（4）在追踪观察组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。

6 试验结果的评价

6.1  数据处理

可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现损伤的动物数、损伤的类型和每种损伤的动物百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方法应在试验设计时确定。

6.2  结果评价

28天重复剂量吸入毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和尸检及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物吸入暴露剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其他一般或特殊的毒性作用。在综合分析的基础上得出重复剂量吸入毒性的LOAEL和（或）NOAEL，为人群吸入的定量风险评估提供依据。

7 试验结果的解释

28天重复剂量吸入毒性试验能够提供受试物短期经呼吸系统反复吸入接触引起的毒性作用资料，也可为90天重复剂量吸入毒性试验中受试物的剂量选择提供依据。其试验结果可在有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。

28天重复剂量吸入毒性试验

起草说明

为加强化妆品的监督管理，进一步提高化妆品使用安全性，中国食品药品检定研究院组织开展了28天重复剂量吸入毒性试验方法的研究制定工作。现就工作有关情况说明如下：

一、起草原则

本方法主要参照OECD 在2018 年发布的“化学品检测指南——28天（亚急性）吸入毒性研究”（TG412）编制。写作结构框架按现行《化妆品安全技术规范》进行调整。本标准制定在充分考虑动物福利的前提下，本着科学性、合理性、规范性的指导原则，对某些内容及吸入相关特征指标进行具体化和明确化，同时也尽可能提供多种吸入条件监测方法，突出体现适用性与可操作性。

二、起草过程

本研究于2021年11月由化妆品标准专家委员会立项；在研究和分析国内外相关标准的基础上，起草了本标准文本及编制说明，形成方法草案。

2023年5月本标准草案通过结题专家论证，形成如下意见及结论：按28天重复剂量吸入毒性试验和90天重复剂量吸入毒性试验分别提交方法文本和起草说明，规范方法文本，修改后通过。修改后对外征求意见，根据反馈情况对文本进行修改。

三、与我国已有相关标准的关系

我国现已发布国家标准GB/T 21754-2008《化学品28天/14天重复剂量吸入毒性试验方法》和GB/T 15670.12-2017《农药登记毒理学试验方法 第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验》。本方法在参考上述我国已有相关标准的基础上，主要针对化妆品原料的特点，以现行《化妆品安全技术规范》中亚慢性经口毒性试验和亚慢性经皮毒性试验的写作框架为模板，本着化妆品原料检测适用性及可操作性的原则进行编制。

四、与国际同类标准的关系

本方法以OECD 2018年发布“化学品检测指南——28天（亚急性）吸入毒性研究”（OECD GUIDELINES ON THE TESTING OF CHEMICALS: 28-Day (Subacute) Inhalation Toxicity Study）为依据进行撰写，结合国内实验条件及操作的具体情况，撰写的标准内容基本涵盖了实验对象、实验操作和结果分析的技术要求，重点突出了对的吸入暴露参数的规定和确认。

五、与《规范》中原方法的对比情况

现行《化妆品安全技术规范》中尚无28天重复剂量吸入毒性试验的相关内容，但有亚慢性经口毒性试验和亚慢性经皮毒性试验的相关内容，本标准以上述试验方法的写作框架为模板，重点增加了对吸入相关特征指标规定。