28天/90天重复剂量吸入毒性试验技术指导原则

（征求意见稿）

中国食品药品检定研究院 

一、概述

吸入毒性试验是测试可能经呼吸道进入机体的化妆品原料对呼吸道及全身的损伤及其危害程度。评估受试物的重复剂量吸入毒性特征常是在取得急性吸入毒性的初步信息后才进行28天/90天重复剂量吸入毒性的试验，该项试验用于评估在一定期间内经呼吸道重复接触受试物所引起的健康危害。吸入受试物的危害常受到受试物固有毒性和物理因素（挥发性、粒度的大小等）的影响。

28天重复剂量吸入毒性试验与90天重复剂量吸入毒性试验相似，主要不同在于染毒期限和临床/病理检查范围。

本指导原则适用于化妆品原料。

二、基本原则

（一）具体问题具体分析

重复剂量吸入毒性试验的设计，应尽可能的收集及评估受试物的所有可用信息，以提高研究质量并最大限度地减少动物使用。应根据受试物的特性、化学结构和物理化学性质；任何体外或体内毒性试验的结果；预期用途和人类接触的可能性；结构相关物质的可用 (Q)SAR 数据和毒理学数据；以及来自急性吸入毒性测试的数据信息等设计适宜的试验方法，并对试验结果进行全面的分析与评价。

（二）随机、对照、重复 

吸入毒性试验应遵循毒理学试验随机、对照、重复的基本原则。

三、基本内容

（一）受试物

受试物应注明名称、来源、性状、批号、保存条件、有效期等信息，单一化合物应注明纯度（杂质及含量），混合物应注明主要含有的成分及含量。染毒时，应根据受试物的理化性质、预设染毒浓度及实际使用时的物理状态等因素将受试物制备成相应的可吸入物态（气体、蒸气、气溶胶），有吸湿性及易发生化学反应的受试物应在干燥空气条件下进行染毒，超声雾化时会产热的受试物，应注意选择合理的发生装置。

受试物一般应在没有溶媒和赋形剂的情况下进行测试，必要时，可在受试物中加入适合的溶媒或赋形剂，以助受试物在空气中达到适当的浓度和粒度。溶媒首选水，使用其他溶媒或赋形剂时，应证明溶媒或赋形剂不影响受试物的稳定性，不与受试物反应，不影响受试物的吸收，也不产生毒性。

试验过程中，应定期进行受试物浓度分析，并提供分析报告。

（二）实验动物

通常选择正常、健康的啮齿类动物，首选大鼠，一般用7～9周龄（性成熟），同性别体重差异应在平均体重的20%之内。选用其他种属或品系动物进行吸入毒性试验，应说明理由。

实验动物应符合国家对相应等级动物的质量规定要求，具有实验动物质量合格证明。

染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应实验室饲养环境。如动物拟采用口鼻暴露方式染毒，动物可提前适应口鼻暴露时所用的固定器。

实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。试验期间，动物一般应按性别和染毒浓度分组分笼饲养，每笼动物的数量不应干扰对每只动物的行为观察。

（三）暴露方法

1. 暴露浓度：试验原则上至少应设低、中、高 3个暴露浓度水平的受试物组，以及1个阴性对照组，阴性对照组动物可暴露于洁净空气，或暴露于溶媒和赋形剂，溶媒应尽可能采用水，采用其他溶媒或赋形剂进行试验时，应根据文献报道或预试验确认所采用溶媒或赋形剂是无毒的，否则应同时设立阴性对照组和溶媒对照组。对照组的其他条件均与试验组相同。最大吸入暴露水平的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，否则将会影响结果的评价。低暴露水平组应不出现任何毒性作用。若掌握人群的实际吸入暴露水平，则最低吸入暴露水平应不低于人群的实际吸入暴露水平。中间暴露水平组应引起较轻的可观察到的毒性作用。如有必要，也可设多个中间暴露水平组。在中、低暴露水平组和对照组中，应尽量不造成动物死亡，以保证得到有意义的评价结论。

2. 吸入暴露方式：原则上应根据受试物的性质、可能的使用方式及测试目的选择适合的吸入暴露方式。对于液体、固体及蒸气冷凝形成的气溶胶一般采用口鼻暴露方式染毒。为满足特定的研究目的，也可采用其他暴露染毒方式（如全身暴露方式等），但需给出合理的解释。

口鼻暴露：即仅头部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，试验过程中将动物置于相应固定器内进行吸入暴露。所选用的固定器应不对动物产生额外的应激，应注意与动物体重大小匹配，并确保动物在暴露过程中无法避开吸入染毒气流。

吸入装置应配备动态气流，其通风量至少应超过装置里动物总换气量的两倍。氧含量应不低于19%，并保证每只动物暴露条件稳定均一。如果进入暴露系统的空气体积小于流出体积时，应防止空气经其他途径进入暴露系统使受试物气溶胶稀释。染毒过程中应使装置内保持轻度负压，防止受试物泄露到外部环境中。

全身暴露：将动物置于封闭的染毒柜或腔体内进行吸入暴露。建议每个动物在全身暴露染毒期间应处在独立的空间，以防止动物聚集在一起，通过被毛吸附染毒气溶胶，从而改变气溶胶浓度。

全身吸入暴露装置需配备动态气流，每小时换气约12次～15次，应保证染毒柜内氧含量不低于19%，应保证受试物气溶胶均匀分布于整个染毒柜。染毒柜内应密闭，以防止受试物泄露到外部环境中。保证受试物气溶胶均匀分散的原则，即试验动物所占的总体积应不超过染毒柜体积的5%。

3. 吸入染毒频率：原则上动物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7d。采用口鼻暴露方式时，大鼠每次吸入染毒时间应不超过6h，小鼠每次吸入染毒时间应不超过4h。采用全身暴露方式时，动物每次染毒时间应不少于6h，最长不超过22h。如试验超出上述时间限制，应提供合理的理由。当吸入染毒时间超过6h，则需在染毒期间以适合方式给动物喂食，如为全身暴露应在暴露期提供饮水。

（四）暴露条件的监测

1. 浓度监测

应定期检测气溶胶的实际浓度，以证明暴露条件的稳定性。一般气体或挥发性受试物浓度的波动范围不得超过平均浓度±10%；液体或固体受试物气溶胶浓度的波动范围不得超过平均浓度的±20%。试验过程中，也应计算理论浓度及其与实际浓度的比值，以证明仪器发生效率的稳定性。

2. 粒径监测

气溶胶颗粒的空气动力学粒径决定了在重力作用下颗粒在呼吸道中的沉降情况；气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差（GSD）代表气溶胶粒度分布范围，其值越大代表粒子分布较广。为了使动物整个呼吸道充分暴露于受试物中，推荐的气溶胶颗粒空气动力学中值直径（MMAD）数值应介于1μm～3μm，GSD通常应介于1.5～3之间。建议采用基于质量检测的碰撞法，基于激光飞行法的光学方法或其它替代方法定期对呼吸区或染毒柜中的气溶胶粒径进行测定，并计算GSD值。如MMAD和GSD不满足上述条件，应给出合理解释。

3.暴露装置内气流监测

通过染毒柜或口鼻暴露系统的气流速率需严格控制，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。

4.暴露系统内环境监测

暴露系统内温度维持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系统都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。理想的相对湿度一般在30%～70%，但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水基受试物时），应给出合理解释。为保证动物的正常呼吸，氧气的浓度应不低于19%，二氧化碳的浓度应不超过1%。可自动记录或定时手动记录以上暴露系统内环境参数。

（五）检测指标

28天/90天重复剂量吸入毒性试验检测指标详见附录（一）。此外，还应结合受试物的特点及其他试验中已观察到的改变或背景信息（如受试物毒性的文献报道等），在不影响正常毒性观察和检测的前提下增加合理的指标。实验动物相关指标的历史背景数据在28天/90天重复剂量吸入毒性试验中具有重要的参考意义。

在染毒结束动物安乐死时对对照组和所有受试物浓度组进行一次全面检测；当进行90天重复剂量吸入毒性试验时，也可根据研究需要选择合适的时间点进行阶段性检测；试验期间对濒死或死亡动物应及时采集标本进行检测，分析濒死或死亡的原因；追踪观察期结束时对受试物高浓度组和对照组剩余动物进行一次全面的检测。

染毒结束，对各组动物进行系统的大体解剖，称重主要脏器并计算脏器系数；受试物高浓度组、对照组动物及大体解剖异常动物应进行详细的组织病理学检查，如受试物高浓度组动物某一组织发生病理改变，需要对其他受试物浓度组动物的相同组织进行组织病理学检查，如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。

四、结果分析与评价

28天/90天重复剂量吸入毒性试验的最终目的在于预测人体吸入受试物的剂量安全范围及可能出现的毒性反应。只有通过对试验结果的科学分析和全面评价才能够清楚描述动物的毒性反应，并推断其安全吸入剂量以及与人体的相关性。

（一）试验结果的分析

分析28天/90天重复剂量吸入毒性试验结果，判断动物是否发生毒性反应及毒性靶器官，描述毒性反应的性质和程度（包括毒性反应的起始时间、程度、变化规律和消除时间），如果有动物死亡应分析死亡原因，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。

1. 正确理解试验数据的意义

在对重复剂量吸入毒性试验结果进行分析时，应正确理解均值数据和个体数据的意义。啮齿类动物重复剂量吸入毒性试验中各组均值的意义通常大于个体动物数据的意义，实验室历史背景数据和文献数据可以为结果的分析提供参考。在分析重复剂量吸入毒性试验结果时应综合考虑数据的统计学意义和生物学意义，正确利用统计学假设检验有助于确定试验结果的生物学意义，要考虑具有统计学意义并不一定代表具有生物学意义；在判断生物学意义时要考虑参数变化的剂量-反应关系、其他关联参数的改变、与历史背景数据的比较等因素；分析试验结果时，对出现的异常数据应判断是否由受试物毒性引起并给予科学解释。

2. 正确判断毒性反应

受试物组和对照组之间检测结果的差异可能来源于受试物有关的毒性、动物对受试物的适应性改变或正常的生理波动，也可能源于试验操作失误和动物应激。在分析试验结果时，应关注参数变化的剂量－反应关系、组内动物的参数变化幅度和性别差异，同时综合考虑多项毒理学指标的检测结果，分析其中的关联和受试物作用机制，以正确判断受试物的毒性反应。单个参数的变化往往并不足以判断化合物是否引起毒性反应，可能需要进一步进行相关的试验。

（二）动物毒性反应对于人体毒性评估的意义

将重复剂量吸入毒性试验结果外推至人体时，首先，不同物种、同物种不同种属或个体之间对于某一受试物的毒性反应可能存在差异；其次，难以预测一些在人体中发生率较低的毒性反应或仅在小部分人群中出现的特异质反应；另外，有些毒性反应目前在动物中难以观察，如头痛、头昏、头晕、皮肤搔痒、视物模糊等。鉴于以上原因，动物重复剂量吸入毒性试验的结果仅可在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。

（三）综合评价

重复剂量吸入毒性试验结果应结合毒性效应指标、大体解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物吸入暴露剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其他一般或特殊的毒性作用。在综合分析的基础上得出28天或90天重复剂量吸入毒性的NOAEL或LOAEL，为人群吸入的定量风险评估提供依据。

五、名词解释

气溶胶（aerosol）：悬浮在空气中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固态、液态或固液态混合颗粒状物质。

空气动力学直径（aeodynamic equivalent diameter, AD）：是描述气溶胶颗粒大小的专用术语。将不同形状和密度的气溶胶颗粒与不同直径的标准单位密度（1.0 g/cm³）球形颗粒相对比，当它们的终端沉降速度相同时，就以该标准球形颗粒的直径表示此气溶胶颗粒的直径，并称之为该气溶胶颗粒的空气动力学直径，其计量单位为μm。

空气动力学质量中值直径（mass median aerodynamic diameter, MMAD）：是指由空气动力学直径大小不一的颗粒组成的气溶胶样品中，小于和等于某一空气动力学直径（例如5μm）的颗粒占气溶胶样品总质量或总重量50%时，则该气溶胶颗粒空气动力学直径即为此气溶胶样品的质量中值空气动力学直径（5μm）。

几何标准差（geometric standard deviation, GSD）：气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差，用以描述气溶胶颗粒大小的均一性或离散程度。几何标准差越小，含相似大小的颗粒比例越高，亦即气溶胶颗粒的均一性越好，离散度越低。

理论浓度（nominal concentration）：制备气溶胶所用受试物的量除以通过暴露系统的空气总体积得到的参数。

实际浓度（analytical concentration）：是指暴露系统中动物呼吸区经采样分析获得的受试物气溶胶浓度。

六、参考文献

1.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 412：28-day (subacute) inhalation toxicity study. 2018

2.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 413：90-day (subchronic) inhalation toxicity study. , 2018

3.国家标准GB/T 21765-2008 化学品亚慢性吸入毒性试验方法。

4.国家标准GB/T 21765-2008 化学品28天/14天重复剂量吸入毒性试验方法。

5.国家标准GB/T 13277.1 压缩空气：污染物净化等级

6.国家标准GB/T 18664-2002 呼吸防护用品的选择、使用与维护

七、注释

（一）最大吸入浓度设计的考虑

最大吸入浓度设计应考虑：①受试物可达到的最大浓度；②人体可能的最大暴露水平；③维持充足的氧气供应的需要；④动物福利。在缺乏限值数据支持的情况下，可参考化学品分类和标记全球协调制度（GHS）的急性限值，即气溶胶最大浓度为5 mg/L，蒸气的最大浓度为20 mg/L，气体最大浓度为20000 ppm。

（二）卫星组的设置

考虑到28天/90天毒性试验的重要性，如计划在试验过程中增加影响毒性试验结果的操作时（如毒代动力学试验、全肺支气管肺泡灌洗液分析等），应考虑适当增加每组动物数，设有代表性的卫星组。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。

八、附录

（一）检测指标

（二）28天重复剂量吸入毒性试验

1 范围

本规范给出了啮齿类动物28天重复吸入毒性试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于检测化妆品原料的28天重复吸入毒性。

2 试验目的

对于有短期反复吸入暴露可能的化妆品原料，需进行28天重复吸入毒性试验。通过该试验不仅可获得一定时期内反复吸入受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计吸入的无有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量风险评估。

3 术语与定义

28天重复剂量吸入毒性：是指在有限时间（28天）内，每日反复通过吸入途径接触受试物后所引起的不良反应。

气溶胶（aerosol）：悬浮在空气中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固态、液态或固液态混合颗粒状物质。

空气动力学直径（aeodynamic equivalent diameter, AD）：是描述气溶胶颗粒大小的专用术语。将不同形状和密度的气溶胶颗粒与不同直径的标准单位密度（1.0 g/cm3）球形颗粒相对比，当它们的终端沉降速度相同时，就以该标准球形颗粒的直径表示此气溶胶颗粒的直径，并称之为该气溶胶颗粒的空气动力学直径，其计量单位为μm。

空气动力学质量中值直径（mass median aerodynamic diameter, MMAD）：是指由空气动力学直径大小不一的颗粒组成的气溶胶样品中，小于和等于某一空气动力学直径（例如5μm）的颗粒占气溶胶样品总质量或总重量50%时，则该气溶胶颗粒空气动力学直径即为此气溶胶样品的质量中值空气动力学直径（5μm）。

几何标准差（geometric standard deviation, GSD）：气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差，用以描述气溶胶颗粒大小的均一性或离散程度。几何标准差越小，含相似大小的颗粒比例越高，亦即气溶胶颗粒的均一性越好，离散度越低。

理论浓度（nominal concentration）：制备气溶胶所用受试物的量除以通过暴露系统的空气总体积得到的参数。

实际浓度（analytical concentration）：是指暴露系统中动物呼吸区经采样分析获得的受试物气溶胶浓度。

4 试验的基本原则

以不同剂量受试物每日吸入给予各组实验动物，连续染毒28d天，每组采用一个吸入剂量染毒。染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行称重和大体解剖。染毒期结束，处死存活动物，进行大体解剖以及适当的病理组织学检查，以评估受试物产生的吸入毒性作用。

5 试验方法

5.1 受试物

受试物可分为气态受试物、沸点较低易挥发的液态受试物、高沸点不易挥发液态受试物、粉状或固体受试物。试验时将受试物制备成何种物态（气溶胶、粉尘）取决于受试物的理化性质、设定的浓度和/或按照实际加工使用期间的物理状态等。吸湿性的及会发生化学反应的受试物，在试验中需保证所用空气干燥，某些受试物经超声雾化时会产热，应注意选择合理的发生装置。

5.2 实验动物和饲养环境

5.2.1 动物种系的选择

常规选择啮齿类动物，首选大鼠。一般选用7周-9周龄的成年大鼠。每个性别动物体重的变动范围不应超出动物平均体重的20%。

5.2.2 动物的性别和数量

每一浓度组及阴性（溶媒）对照组实验动物至少应有10只（雌雄各半）。可另设追踪观察组，每组至少10只动物（雌雄各半），给予最高浓度受试物或阴性（溶媒）对照品。

考虑到28天重复吸入毒性试验的重要性，应适当增加每组动物数。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。追踪观察组动物在全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于14d），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。

5.2.3试验前动物准备

染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应实验室饲养环境。如动物拟采用口鼻暴露方式染毒，动物还需提前适应口鼻暴露时所用的固定器。

5.2.4饲养环境

实验饲养室内温度应控制在20℃～25℃，相对湿度在应控制在40%～70%范围内。采用人工照明，每12h明暗交替。试验期间，动物常规进食，自由饮水。当动物吸入染毒时间超过6h，则需在染毒期间以适合方式给动物喂食，并提供饮水。当动物采用全身暴露方式染毒时，在暴露期间应单笼饲养，以防止动物聚集趴卧，其被毛吸附受试物气溶胶，影响动物吸入受试物的量。

5.3 分组

试验通常包括三个暴露水平的受试物和一个阴性/溶媒对照。阴性/溶媒对照组动物暴露于洁净空气或溶媒，对照组的其他条件均与试验组相同。最大吸入暴露水平的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，低暴露水平组应不低于人群的实际吸入暴露水平，且不出现任何毒性作用，中间暴露水平组应引起较轻的可观察到的毒性作用。

吸入染毒途径不同与其它染毒途径，其暴露水平主要通过调整气溶胶浓度，保持相同的吸入暴露时间来实现。也可调整吸入暴露时间，保持气溶胶浓度不变来实现（如采用此种方式，需排除暴露时间不一致对动物的影响）。

吸入试验中动物暴露水平通常以递送剂量表述，即气溶胶发生后经动物吸入的气溶胶的量。可根据试验周期中测得气溶胶浓度、每分钟通气量、暴露时间计算求得公式如下：

每分钟通气量(L/min)=0.608×平均体重(kg)^0.852

每分钟通气量可采用实际检测动物的每分钟通气量计算。也可以动物平均体重代入经验公式得出动物理论每分钟通气量。

5.4 吸入暴露参数

5.4.1 吸入暴露方式

首选的暴露方式为口鼻暴露，为满足特定的研究目的（如便于染毒中观察动物反应），也可采用全身暴露方式染毒，但应在试验报告中予以阐释说明。

5.4.2 吸入染毒频率

染毒期间，动物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7d。

5.4.2 吸入染毒时间

原则上，各组动物吸入染毒时间应一致，当采用调整吸入染毒时间来区分各组暴露水平时，各组吸入染毒时间相差不应太长，否则需要考察染毒时间不一致对动物的影响。采用口鼻暴露方式时，大鼠的吸入染毒时间应不超过6h，小鼠的吸入染毒时间应不超过4h。采用全身暴露方式时，动物的染毒时间应不少于6h，最长不超过22h。如确需超过上述时间限制，应在试验报告中予以阐释说明。

5.5 暴露条件的监测

5.5.1浓度监测

试验期间为保证实际浓度的稳定性，可以使用实时监测设备（如气溶胶光度计），或定期通过特异性的方法（如采用撞击器吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行化学分析），或非特异性的方法如滤膜采样法来测定呼吸区或染毒柜内气溶胶浓度，以证明暴露条件的稳定性。浓度波动范围规定：气体或挥发性受试物不得超过平均浓度±10%；液体或固体气溶胶不得超过平均值的±20%。

5.5.2粒径监测

可采用基于质量检测的碰撞法、基于激光飞行法的光学方法或其它替代方法定期对呼吸区或染毒柜中的气溶胶粒径进行测定。如在整个试验周期中采用替代方法进行粒径分析时，需验证替代方法所得结果与碰撞法一致。

5.5.3 暴露装置内气流

通过染毒柜或口鼻暴露系统的气流速率需严格控制，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。

5.5.4 暴露系统内环境监测

暴露系统内温度维持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系统都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。理想的相对湿度一般在30%～70%，但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水基受试物时），应在试验报告中予以阐释说明。氧气的浓度不低于19%，二氧化碳的浓度不超过1%。

5.6 临床观察

试验期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应在首次染毒前（第0天）记录动物体重，此后每周2次测定动物体重，如前2周发现染毒对动物体重没有影响，则可在剩余的研究中每周测定动物体重。应测定每周饲料消耗量。

5.7 临床检查

5.7.1 眼科检查

在动物染毒前和染毒后，至少应对最高剂量组和对照组动物，使用眼科镜或其他有关设备进行眼科检查。若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查。

5.7.2 血液检查

在染毒结束及追踪观察结束时应测定血球容积、血红蛋白浓度、红细胞数、白细胞总数和分类，必要时测定凝血功能如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激酶时间或血小板数等指标。

5.7.3 临床血液生化检查

在染毒结束及追踪观察结束时进行，检查指标包括电解质平衡、碳水化合物代谢、肝、肾功能。可根据受试物作用形式选择其他特殊检查。推荐的指标包括：氯、钠、钾、禁食血糖（不同动物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶、γ谷氨酰转肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、总胆红素及总血清蛋白。必要时可进行脂肪、激素、酸碱平衡、正铁血红蛋白、胆碱酯酶活性的分析测定。此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其他更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒性评价。

5.7.4 尿液检查

一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。

5.7.5 支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）检查

解剖动物取肺脏，整肺称重后结扎左肺用于组织病理学检查，右肺进行BAL，分析BAL液的白细胞计数和分类、总蛋白、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶以及炎症相关细胞因子/趋化因子等参数。BAL液分析通常作为组织病理学检查的结果的补充，但不能替代组织病理学检查。

5.8 病理检查

5.8.1 动物解剖和大体病理学检查

所有动物均应进行全面的大体解剖，内容包括动物的外观、所有孔道，胸腔、腹腔及其内容物。肺、肝、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、脾、脑和心脏应在分离后尽快称重以防水分丢失。应将下列组织和器官保存在固定液中，以备日后进行病理组织学检查：所有大体解剖呈现异常的器官、脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体）、甲状腺/甲状旁腺、胸腺、左肺/气管、喉、鼻咽组织、心脏、主动脉、唾液腺、肝、脾、肾、肾上腺、胰、性腺、子宫、生殖附属器官*、皮肤*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、膀胱、前列腺、有代表性的淋巴结、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周围神经、胸骨（包括骨髓）、眼及视神经、股骨（包括关节面）*、脊髓（包括颈部、胸部、腰部）*和泪腺*。

*只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官。

5.8.2 病理组织学检查

应对下述器官和组织进行检查：

（1）所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织，如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学的病变，则应扩展至其他剂量组的相应的器官和组织。

（2）各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织。

（3）其他剂量组动物的靶器官。

（4）在追踪观察组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。

6 试验结果的评价

6.1 数据处理

可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现损伤的动物数、损伤的类型和每种损伤的动物百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方法应在试验设计时确定。

6.2 结果评价

28天重复剂量吸入毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和大体解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物吸入暴露剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其他一般或特殊的毒性作用。在综合分析的基础上得出28天吸入毒性的LOAEL和（或）NOAEL，为人群吸入的定量风险评估提供依据。

7 试验结果的解释

28天重复剂量吸入毒性试验能够提供受试物在反复吸入接触时的毒性作用资料。其试验结果可在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。

（三）90天重复剂量吸入毒性试验

1 范围

本规范给出了啮齿类动物90天重复吸入毒性试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于检测化妆品原料的90天重复吸入毒性。

2 试验目的

对于有长期反复吸入暴露可能的化妆品原料，需进行90天重复吸入毒性试验。通过该试验不仅可获得一定时期内反复吸入受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计吸入的无有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量风险评估。

3 术语与定义

90天重复剂量吸入毒性：是指在实验动物部分生存期内，每日反复通过吸入途径接触受试物后所引起的不良反应。

气溶胶（aerosol）：悬浮在空气中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固态、液态或固液态混合颗粒状物质。

空气动力学直径（aeodynamic equivalent diameter, AD）：是描述气溶胶颗粒大小的专用术语。将不同形状和密度的气溶胶颗粒与不同直径的标准单位密度（1.0 g/cm3）球形颗粒相对比，当它们的终端沉降速度相同时，就以该标准球形颗粒的直径表示此气溶胶颗粒的直径，并称之为该气溶胶颗粒的空气动力学直径，其计量单位为μm。

空气动力学质量中值直径（mass median aerodynamic diameter, MMAD）：是指由空气动力学直径大小不一的颗粒组成的气溶胶样品中，小于和等于某一空气动力学直径（例如5μm）的颗粒占气溶胶样品总质量或总重量50%时，则该气溶胶颗粒空气动力学直径即为此气溶胶样品的质量中值空气动力学直径（5μm）。

几何标准差（geometric standard deviation, GSD）：气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差，用以描述气溶胶颗粒大小的均一性或离散程度。几何标准差越小，含相似大小的颗粒比例越高，亦即气溶胶颗粒的均一性越好，离散度越低。

理论浓度（nominal concentration）：制备气溶胶所用受试物的量除以通过暴露系统的空气总体积得到的参数。

实际浓度（analytical concentration）：是指暴露系统中动物呼吸区经采样分析获得的受试物气溶胶浓度。

4 试验的基本原则

以不同剂量受试物每日吸入给予各组实验动物，连续染毒90d天，每组采用一个吸入剂量染毒。染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行称重和大体解剖。染毒期结束，处死存活动物，进行大体解剖以及适当的病理组织学检查，以评估受试物产生的吸入毒性作用。

5 试验方法

5.1 受试物

受试物可分为气态受试物、沸点较低易挥发的液态受试物、高沸点不易挥发液态受试物、粉状或固体受试物。试验时将受试物制备成何种物态（气溶胶、粉尘）取决于受试物的理化性质、设定的浓度和/或按照实际加工使用期间的物理状态等。吸湿性的及会发生化学反应的受试物，在试验中需保证所用空气干燥，某些受试物经超声雾化时会产热，应注意选择合理的发生装置。

5.2 实验动物和饲养环境

5.2.1 动物种系的选择

常规选择啮齿类动物，首选大鼠。一般选用7周-9周龄的成年大鼠。每个性别动物体重的变动范围不应超出动物平均体重的20%。

5.2.2 动物的性别和数量

每一浓度组及阴性（溶媒）对照组实验动物至少应有20只（雌雄各半）。可另设追踪观察组，每组至少10只动物（雌雄各半），给予最高浓度受试物或阴性（溶媒）对照品。

考虑到90天重复吸入毒性试验的重要性，应适当增加每组动物数。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。试验结束时的动物数需达到能够有效评价受试物毒性作用的数量。追踪观察组动物在全程染毒结束后继续观察一段时间（一般不少于28d），以了解毒性作用的持续性、可逆性或迟发毒作用。

5.2.3试验前动物准备

染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应实验室饲养环境。如动物拟采用口鼻暴露方式染毒，动物还需提前适应口鼻暴露时所用的固定器。

5.2.4饲养环境

实验饲养室内温度应控制在20℃～25℃，相对湿度在应控制在40%～70%范围内。采用人工照明，每12h明暗交替。试验期间，动物常规进食，自由饮水。当动物吸入染毒时间超过6h，则需在染毒期间以适合方式给动物喂食，并提供饮水。当动物采用全身暴露方式染毒时，在暴露期间应单笼饲养，以防止动物聚集趴卧，其被毛吸附受试物气溶胶，影响动物吸入受试物的量。

5.3 分组

试验通常包括三个暴露水平的受试物和一个阴性/溶媒对照。阴性/溶媒对照组动物暴露于洁净空气或溶媒，对照组的其他条件均与试验组相同。最大吸入暴露水平的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，低暴露水平组应不低于人群的实际吸入暴露水平，且不出现任何毒性作用，中间暴露水平组应引起较轻的可观察到的毒性作用。

吸入染毒途径不同与其它染毒途径，其暴露水平主要通过调整气溶胶浓度，保持相同的吸入暴露时间来实现。也可调整吸入暴露时间，保持气溶胶浓度不变来实现（如采用此种方式，需排除暴露时间不一致对动物的影响）。

吸入试验中动物暴露水平通常以递送剂量表述，即气溶胶发生后经动物吸入的气溶胶的量。可根据试验周期中测得气溶胶浓度、每分钟通气量、暴露时间计算求得公式如下：

每分钟通气量(L/min)=0.608×平均体重(kg)^0.852

每分钟通气量可采用实际检测动物的每分钟通气量计算。也可以动物平均体重代入经验公式得出动物理论每分钟通气量。

5.4 吸入暴露参数

5.4.1 吸入暴露方式

首选的暴露方式为口鼻暴露，为满足特定的研究目的（如便于染毒中观察动物反应），也可采用全身暴露方式染毒，但应在试验报告中予以阐释说明。

5.4.2 吸入染毒频率

染毒期间，动物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7d。

5.4.2 吸入染毒时间

原则上，各组动物吸入染毒时间应一致，当采用调整吸入染毒时间来区分各组暴露水平时，各组吸入染毒时间相差不应太长，否则需要考察染毒时间不一致对动物的影响。采用口鼻暴露方式时，大鼠的吸入染毒时间应不超过6h，小鼠的吸入染毒时间应不超过4h。采用全身暴露方式时，动物的染毒时间应不少于6h，最长不超过22h。如确需超过上述时间限制，应在试验报告中予以阐释说明。

5.5 暴露条件的监测

5.5.1浓度监测

试验期间为保证实际浓度的稳定性，可以使用实时监测设备（如气溶胶光度计），或定期通过特异性的方法（如采用撞击器吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行化学分析），或非特异性的方法如滤膜采样法来测定呼吸区或染毒柜内气溶胶浓度，以证明暴露条件的稳定性。浓度波动范围规定：气体或挥发性受试物不得超过平均浓度±10%；液体或固体气溶胶不得超过平均值的±20%。

5.5.2粒径监测

可采用基于质量检测的碰撞法、基于激光飞行法的光学方法或其它替代方法定期对呼吸区或染毒柜中的气溶胶粒径进行测定。如在整个试验周期中采用替代方法进行粒径分析时，需验证替代方法所得结果与碰撞法一致。

5.5.3 暴露装置内气流

通过染毒柜或口鼻暴露系统的气流速率需严格控制，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。

5.5.4 暴露系统内环境监测

暴露系统内温度维持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系统都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。理想的相对湿度一般在30%～70%，但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水基受试物时），应在试验报告中予以阐释说明。氧气的浓度不低于19%，二氧化碳的浓度不超过1%。

5.6 临床观察

试验期间对动物的任何毒性表现均应记录，记录内容包括发生时间、程度和持续时间。观察应至少包括如下内容：皮肤和被毛的改变、眼和粘膜变化、呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统、肢体运动和行为活动等改变。应在首次染毒前（第0天）记录动物体重，此后每周2次测定动物体重，如前4周发现染毒对动物体重没有影响，则可在剩余的研究中每周测定动物体重。应测定每周饲料消耗量。

5.7 临床检查

5.7.1 眼科检查

在动物染毒前和染毒后，至少应对最高剂量组和对照组动物，使用眼科镜或其他有关设备进行眼科检查。若发现动物有眼科变化则应对所有动物进行检查。

5.7.2 血液检查

在染毒结束及追踪观察结束时应测定血球容积、血红蛋白浓度、红细胞数、白细胞总数和分类，必要时测定凝血功能如凝血时间、凝血酶原时间、凝血激酶时间或血小板数等指标。

5.7.3 临床血液生化检查

在染毒结束及追踪观察结束时进行，检查指标包括电解质平衡、碳水化合物代谢、肝、肾功能。可根据受试物作用形式选择其他特殊检查。推荐的指标包括：氯、钠、钾、禁食血糖（不同动物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶、γ谷氨酰转肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、总胆红素及总血清蛋白。必要时可进行脂肪、激素、酸碱平衡、正铁血红蛋白、胆碱酯酶活性的分析测定。此外，还可根据所观察到的毒性作用进行其他更大范围的临床生化检查，以便进行全面的毒性评价。

5.7.4 尿液检查

一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。

5.7.5 支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）检查

解剖动物取肺脏，整肺称重后结扎左肺用于组织病理学检查，右肺进行BAL，分析BAL液的白细胞计数和分类、总蛋白、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶以及炎症相关细胞因子/趋化因子等参数。BAL液分析通常作为组织病理学检查的结果的补充，但不能替代组织病理学检查。

5.8 病理检查

5.8.1 大体解剖

所有动物均应进行全面的大体解剖，内容包括动物的外观、所有孔道，胸腔、腹腔及其内容物。肺、肝、肾、肾上腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、脾、脑和心脏应在分离后尽快称重以防水分丢失。应将下列组织和器官保存在固定液中，以备日后进行病理组织学检查：所有大体解剖呈现异常的器官、脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层、脑垂体）、甲状腺/甲状旁腺、胸腺、左肺/气管、喉、鼻咽组织、心脏、主动脉、唾液腺、肝、脾、肾、肾上腺、胰、性腺、子宫、生殖附属器官*、皮肤*、食管、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、膀胱、前列腺、有代表性的淋巴结、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周围神经、胸骨（包括骨髓）、眼及视神经、股骨（包括关节面）*、脊髓（包括颈部、胸部、腰部）*和泪腺*。

*只有当毒性作用提示或作为被研究的靶器官时才需要检查这些器官。

5.8.2 病理组织学检查

应对下述器官和组织进行检查：

（1）所有最高剂量组和对照组动物的重要的和可能受到损伤的器官或组织，如高剂量组动物的器官或组织有病理组织学的病变，则应扩展至其他剂量组的相应的器官和组织。

（2）各剂量组大体解剖见有异常的器官或组织。

（3）其他剂量组动物的靶器官。

（4）在追踪观察组，应对那些在染毒组呈现毒性作用的组织和器官进行检查。

6 试验结果的评价

6.1 数据处理

可通过表格形式总结试验结果，显示试验开始时各组动物数、出现损伤的动物数、损伤的类型和每种损伤的动物百分比。对所有数据应采用适当的统计学方法进行评价，统计学方法应在试验设计时确定。

6.2 结果评价

90天重复剂量吸入毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和大体解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物吸入暴露剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其他一般或特殊的毒性作用。在综合分析的基础上得出90天吸入毒性的LOAEL和（或）NOAEL，为人群吸入的定量风险评估提供依据。

7 试验结果的解释

90天重复剂量吸入毒性试验能够提供受试物在反复吸入接触时的毒性作用资料。其试验结果可在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。